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　　問題解析：熒光定量PCR反應結束無擴增曲線

　　熒光定量 PCR反應結束無擴增曲線出現(xiàn)這個問題的常見原因，主要可以歸結為以下幾種：

　　反應循環(huán)數(shù)不夠：一般建議設置循環(huán)數(shù)為 40。

　　程序中未設置信號采集步驟：注意，兩步法擴增程序一般將信號采集設置在退火延伸階段;三步法擴增程序應當將信號采集設置在 72 度延伸階段。

　　引物降解：長時間未使用的引物應先通過 PAGE 電泳檢測完整性，以排除引物降解的可能性。

　　模板濃度太低：這個大家減少稀釋度重復實驗就可以了，一般來說，未知濃度的樣品先從最高濃度做起。

　　模板降解：無解，請重新制備模板，可以重復實驗。

　　溶解曲線形狀異常

　　(1)雜峰在主峰之前，Tm 約為 70 - 75℃——一般為引物二聚體

　　這種情況主要有三個解決方法：

　　重新設計引物;

　　雜峰為引物二聚體，熒光定量 PCR引物二聚體主要是由于體系內(nèi)引物與引物糾纏比引物與模板結合更容易導致的，可以嘗試提高模板濃度、退火溫度或者降低引物濃度來進行改善;

　　另外，當目的基因表達量極低時，染料法容易形成引物二聚體產(chǎn)物影響實驗結果，此時，建議使用探針法定量。

　　(2)雜峰在主峰之后，非引物二聚體

　　上圖這種情況就是非特異性擴增，可能是引物特異性不好引起的，也可能是空氣中有氣溶膠污染所導致。

　　大家可以先增加退火溫度再試試看，如果沒有改善，那么就需要重新更換引物啦。

　　為了避免這種麻煩，BUNSEN本生小編建議大家在進行熒光定量 PCR實驗之前，就對自己的引物做一個特異性驗證。另外，每次試驗的 NTC(no template control)是一定要做的。

　　(3)只有引物二聚體，無目的條帶

　　如果擴增片段過短(小于 80bp)，那么僅通過融解曲線就很難區(qū)分引物二聚/目的條帶。

　　另外，也有可能是 熒光定量 PCR 擴增效率低或者沒有擴增，體系里邊只有引物糾纏成的二聚體了。

　　總之，產(chǎn)物長度建議大家還是設置在 100 - 200 bp，不要太短了。

　　注：以上資料僅供參考!

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